少女时代的伊莎贝尔很不顺利，恩里克继位后，她同母亲、弟弟阿方索搬到阿雷瓦洛一个幽闭的城堡里居住。其母(与女同名，也叫伊莎贝尔)患有精神病，时而发作。但这并不影响伊莎贝尔受到来自萨拉曼卡大学的老师们的良好教育。1468年，对恩里克四世不满的贵族们拥立阿方索为王，一场兄弟阋墙的内战由此开始，不久阿方索突然死去，反对恩里克四世的贵族又抬出了伊莎贝尔公主来继续与之对抗。最后双方终于达成和议，停止内战，全体贵族都必须宣誓效忠恩里克四世，伊莎贝尔公主则成为王位继承人，但规定她的婚事必须得到王兄的批准。
西班牙女王伊莎贝尔一世画像
十分有心计的伊莎贝尔公主派亲信侍从到各国去私访年轻王子。反馈回来的结论是，阿拉贡王子斐迪南品貌出众、英勇善战。伊莎贝尔便与斐迪南通信往来，最后终于私定终身。但恩里克四世却要把她嫁给葡萄牙鳏居的国王阿丰索五世，企图把伊莎贝尔抓起来。于是，1469年，伊莎贝尔迅速同斐迪南王子订婚，然后借助阿拉贡的军队武力反抗王兄的干涉。这段看来像戏剧的风流韵事，最终成全了西班牙作为一个国家的统一。
恩里克四世以伊莎贝尔不遵守协议为由，剥夺了她的继承权，改立他自己的女儿胡安娜，但由于恩里克有性无能之名，多数贵族均认为胡安娜的血统存在疑问。1474年，恩里克死，伊莎贝尔和胡安娜均宣布自己继位，她们分别借助夫家阿拉贡和葡萄牙的力量，得到国内一部分贵族的支持。经过4年战争，葡萄牙军队被击败，伊莎贝尔终于坐稳了王位。1479年，斐迪南也继承了阿拉贡王位，两国合而为一，成为西班牙王国(但两国仍然维持各自独立的议会、法律和税制)。
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