1927年8月1日，根据中共中央决定，以周恩来为书记的中共前敌委员会在南昌成功领导了武装起义，打响了武装反抗国民党反动派的第一枪。这是中国共产党独立领导武装斗争和创建自己的革命军队的伟大开端。南昌起义部队的显著特点就是，参加起义的武装主要是由在大革命时期我党直接掌握的部队和受我党影响较大的部分国民革命军的部队所组成，基础比较好。为使起义部队置于党的领导之下，我党在组织起义时，就明确提出：起义军中“党的组织是一切组织的根源”，“党的作用高于一切”（《南昌起义》（资料选辑）第26、65页，中共中央党校出版社1981年版）。为了从组织制度上保证中国共产党对部队的领导，起义部队建立了党的各级组织。中共前敌委员会为起义部队的最高领导机关，军、师两级建立了党委，各团建立了党总支或党支部，有的连队也建立了党支部。党组织一方面要求党团员和党员干部起模范带头作用，教育全体官兵从思想上、政治上和组织上拥护共产党；另一方面还积极在部队中发展新党员，8月底9月初，党的前敌委员会在瑞金吸收了贺龙、郭沫若等一批优秀分子入党。为了加强党的领导，还建立了党代表和政治机关。这些做法是对北伐战争时期政治工作制度的继承与发展，也为后来各地武装起义部队做了楷模。
    周恩来对朱毛红军在部队中系统建立党组织的新经验非常重视，给予了充分肯定并在全军大力推广。1929年3月17日， 他在为中央起草致贺龙及湘鄂西前委的指示中说：“在朱、毛军队中，党的组织是以连为单位，每连建立一个支部，连以下分小组，连以上有营委、团委等组织。因为每连都有组织，所以在平日及作战时，都有党的指导和帮助。据朱、毛处来人说，这样组织，感觉还好。将来你们部队建党时，这个经验可以备你们参考”。1930年1月， 周恩来主持的《军事通讯》创刊号全文刊登了陈毅在中共中央军事会议期间撰写的《关于红四军历史及其情况的报告》，并配发编者按，指出，这是很值得我们宝贵的一个报告。在周恩来的大力倡导下，各地红军纷纷仿效红四军的做法建立起了党的组织。例如，邓小平在组建红七军时，按照红四军的做法，“以最大力量来注意党的组织问题”。党中央对此给予肯定，指出红七军“能利用朱毛红军的经验，这是对的”。（转引自姜思毅：《中国人民解放军政治工作史》第94页）在各地红军彼此隔绝的情况下，上述作法对于红四军政治工作经验的传播和推广，对于整个红军政治工作的建设和发展，有极其重要的意义。
    周恩来为古田会议的召开和古田会议决议的产生起了至关重要的作用。红四军的建军经验是在三湾改编经验的基础上发展起来的，反映了毛泽东在建军思想和建军原则上的正确主张，是对我军政治工作的一个创造。但是，红四军建军伊始，领导内部在建军问题上就存在着分歧，一些受旧式军队影响较深的同志不赞成毛泽东的意见。1929年4、5月间，一些刚从苏联回国的同志进入红四军领导层，他们竭力主张照搬苏军当时所实行的“一长制”（苏军1925年开始实行，此时比较普遍）等做法。这样两种反对意见结合在一起，使矛盾骤然尖锐起来。他们错误地认为红军的根本任务就是打仗，反对建立根据地；主张党对军队只能指导，不能领导，要求限制前委、党代表的权力；认为军事高于一切，“司令部对外”，政治部隶属军事机关；赞成旧式军队军阀主义的管理方式，主张打骂体罚，要求取消士兵委员会。为从根本上解决所争论的问题，6月中旬第三次攻克龙岩后，红四军党的第七次代表大会于6月22日召开。但是，由于各方面条件尚不成熟，没有能够统一认识，以毛泽东为代表的正确主张未被多数人所接受，以致毛泽东没能当选为前委书记，不久离开部队到闽西指导地方工作并养病。红四军党的前委领导因毛泽东的离去受到削弱，随后又错误出击闽中在军事上遭到损失，结果人心浮动，思想混乱，逃兵严重。9月，召开党的第八次代表大会， 仍无结果。红四军面临着向何处发展的重大抉择。
    在这紧要关头，得到中央的正确领导和思想上、组织上的大力支持是至关重要的。由于红四军在全国红军中的影响，这实际上也关系到整个红军的前途和命运。周恩来在组织上坚决支持毛泽东，在思想上给红四军以正确指导。周恩来在听取了红四军党的前委书记陈毅汇报后，首先明确指出，红四军党的第七次代表大会和前委扩大会对领导内部分歧问题的处理不当，要求毛泽东应仍任前委书记，并须使红四军全体同志了解和接受；指示陈毅回去后请毛泽东复职，并召开会议，统一思想，分清是非，作出决议，维护朱毛领导。其次，就红四军在红军建设原则上所提出的一系列问题作出了明确的回答。这主要体现在“九月来信”上。要点如下：一是规定了红军的基本任务。指出：“目前红军的基本任务主要的有以下几项：一、发动群众斗争，实行土地革命，建立苏维埃政权；二、实行游击战争，武装农民，并扩大本身组织；三、扩大游击区域及政治影响于全国。”强调：“红军不能实现上面三个任务，则与普通军队无异。”二是肯定了党对军队绝对领导的原则。指出：“党的一切权力集中于前委指导机关，这是正确的，绝不能动摇。不能机械地引用‘家长制’这个名词来削弱指导机关的权力，来作极端民主化的掩护。”三是明确政治机关与军事机关的关系。认为红军的军事机关与政治机关是在前委指导下平行地执行工作。党“经过军部指挥军事工作，经过政治部指挥政治工作”。四是赞成集中指导下的民主制度，肯定士兵委员会的作用，强调要“坚决地废除肉刑”。五是提出“加强无产阶级意识的领导”，“纠正一切不正确的倾向。”（《周恩来选集》上卷第33－41页）
    周恩来的上述意见为统一红四军内部的认识，确立正确的建军思想、建军原则，以及为成功召开古田会议并作出相应决议创造了条件。“九月来信”也是我党我军历史上第一次比较系统地阐述我军建军思想的全党全军性的文件，是党的建设、军队建设以及军队政治工作建设的一块重要的奠基之石，在党史、军史以及军队政治工作史上占有重要的地位。
    周恩来主持制定了我军第一个正式的政治工作条例。随着革命形势的不断发展，中国工农红军队伍日益扩大，政治工作的范围更加广泛，所承担的任务越来越重，这就需要制定出政治工作的规章制度，以克服政治工作中不平衡、不协调的情况，保证政治工作有条不紊地进行。1930年8月中旬，周恩来从苏联回国到上海。 立即向中共中央传达了共产国际的指示精神，强调加强红军建设，集中对红军的领导，并提出了一系列的措施。加强红军政治工作制度建设，制定红军政治工作条例，是其中的一个重要内容。周恩来一方面组织刚从苏联留学回来的刘伯承、傅钟、李卓然等翻译傅钟从托尔马乔夫军事政治学院带回的《苏联红军政治工作条例》；（参见：傅钟《征途集》第220-221页，《刘伯承传》第87页）另一方面在借鉴苏联红军政治工作条例，总结国民革命军特别是中国工农红军政治工作经验的基础上，主持制定了《中国工农红军政治工作暂行条例草案》（以下简称《条例草案》）。9月30日， 在周恩来主持召开的中共中央军委扩大会议上，讨论了《条例草案》，并于11、12月间正式颁发。（见中国人民解放军政治学院政治工作教研室：《军队政治工作历史资料》第二册第330 页）《条例草案》由总则和政治指导员工作、政治委员工作、政治处工作、军师政治部工作、军区及集团军政治部工作、总政治部工作、党的连支部及团委工作、党务委员会工作、青年团工作、政治机关及党部与地方党部关系等10个单项暂行条例组成。这是我军政治工作的第一个正式条例，对于我军政治工作系统化、制度化建设具有重要意义。
    这一时期，周恩来进一步发展了军队政治工作理论，为毛泽东军队政治工作思想的形成作出了重大贡献。他提出了在红军中党的领导要有最高权威；政治工作是红军的生命线；政治工作的作用是保证作用；战时更需要加强政治工作；瓦解敌军是政治工作的重要内容；军队的政治工作要重点做好士兵的工作等理论观点。
    从以上所述可见，周恩来在这一时期对我军政治工作创建和形成作出了巨大贡献，他的理论和实践都为毛泽东政治工作思想的形成和发展起了极为重要的作用。可以这样说，毛泽东作为我军政治工作的一代宗师，他的思想凝聚着周恩来的智慧。周恩来的名字与他所创造的军队政治工作事业永远同在，他的军队政治工作的理论与实践，对于现在和将来加强改进军队政治工作具有重大现实意义和深远的历史意义。