与此同时，这24架飞机的机组人员全部征集完毕，前往改造中心所在地明尼阿波利斯，从1942年3月1日开始陆续驾驶改装好的24架B-25B飞往佛罗里达州的Eglin机场。在那里，机组人员接受为期三周的高强度训练，将第8空军基地Auxiliary1号机场的Wagner滑行跑道涂装成航母甲板，驾驶B-25B模拟起飞，并进行低空飞行，夜航，低空投弹和水上导航。美国海军彭沙科拉航空站的Henry Miller中尉监督起飞训练。他的努力博得了杜立特的赏识，被认为是功不可没的一员。杜立特中校在他的任务总结报告中提到，尽管训练的三周里出现的雨雾天气一度使训练变得不可能，但小组还是克服困难，达成了训练的预期目标。训练期间，一架B-25B在起飞时发生事故，严重受损。另有一架则在滑行时前轮发生振动。这两架均因无法及时修复，杜立特决定放弃这两架。
     1942年3月25日，剩下的22架B-25B从Eglin起飞，抵达加州McClellan机场。两天后飞往萨克拉门托飞机补给站进行最终的调整。接着在3月31日，总共16架确定参加任务的B-25陆续飞往加州海军阿拉米达航空站。随后，航母大黄蜂号抵达阿拉米达，其中的15架执行投弹任务，率先搬上航母。但在第16架B-25的登船问题上，海军担心甲板上容不下，故一直阻挠。杜立特团队与海军方面持续商谈，直到航母将要出发前的最后一刻，海军才同意放行，得以让第16架B-25挤上大黄蜂号甲板，参与空袭行动。整个行动始终采取高度保密措施，参与行动的所有成员直到大黄蜂从旧金山出发之后才被告知此次任务的内容。
     1942年4月1日，16架经过改造的B-25轰炸机和每架5名机组成员，再加上地勤维护人员，总计71名文职和130名作战人员，从旧金山的阿拉米达登上了大黄蜂号。每架B-25配备了4枚特别定制的500磅(225公斤)炸弹。4枚炸弹中，3枚填装高爆炸药，1枚为子母燃烧弹。这种燃烧弹呈长条棒状，上百根捆绑在一起挂入投弹舱。在投出机舱后，会分散开来，大面积燃烧目标。在行动出发后由全体作战人员合影留念时，杜丽特中校颇具深意地在5枚炸弹的尾翼系上了日本的“友好”奖章——都是在战前由日本政府授予美军官兵的奖章。杜丽特非常明白地告诉大家，用炸弹顺路帮个忙，让这些个虚伪的奖章统统滚回老家。摄影师真实地记录下了这一场景，成了太平洋战争史上最为著名的珍贵照片之一。

     轰炸机的防护方面，由于战斗机航程短无法提供护航，防护就只能仰赖机舱上方的两挺12.7毫米口径机枪和头部的一挺7.62毫米口径机枪，机腹和尾部的机枪均已拆除。所有的16架飞机按照实际起飞的顺序簇拥着排列在大黄蜂甲板之上，大黄蜂本身的舰载机只能存入甲板下的机库。
     4月2日上午10时，大黄蜂带领的第18机动舰队驶离阿拉米达。数天后，由威廉·哈尔西中将指挥，拥有企业号航母的第16机动舰队在夏威夷以北海域与第18机动舰队会合。企业号上的战斗机和巡逻机为大黄蜂号和整个舰队提供空中保护，这支特混舰队有：
     第16与第18机动舰队会合后一并向西航行，全程无线电静默。4月17日下午补给舰为舰队补充完燃油之后，与8艘驱逐舰向东后撤，航母和巡洋舰继续向西，以20节的速度朝日军控制的海域快步前进。在那里，16架B-25准备起飞。

令杜立特没有想到的是，舰队尚未抵达起飞地点，竟如此早地被日军发现了。因担心接到警报的日本很可能已出动兵力前来阻击，舰队若再往前行就会非常危险。杜立特和大黄蜂号舰长马克·米切尔决定，所有B-25立即起飞——比原计划提前10小时，意味着B-25将多飞310公里。待16架B-25依次排开发动引擎之后，留给杜立特起飞的滑行距离只有467英尺(142米)。16架B-25在8：20至9：19之间的一个小时之内全部成功起飞。第16架B-25原本只随同机队进行观测和拍摄，因计划有变，杜立特决定16架B-25全部用于轰炸。对美军来说，这是第一次，也是唯一一次陆基轰炸机从航母上起飞执行任务。