奥地利终于忍耐不住俾斯麦咄咄逼人的态势。鉴于无法与普鲁士在两公国问题上达成谅解，奥地利决定争取德意志中小邦的支持来打击普鲁士的野心。6月1日奥地利宣布，因无法与普鲁士达成一致意见，决定将两公国的治理和前途问题提交邦联议会处理。其目的在于让普鲁士在两公国问题上与整个邦联为敌。接着奥地利又决定召开荷尔斯泰因议会，讨论其今后的地位。
    俾斯麦等待的时机终于来了。他立即宣称，奥地利之举已经破坏了奥普共有两公国的加斯泰因公约，遂命令普军于6月7日开进了奥地利管理的荷尔斯泰因。6月14日，德意志邦联议会通过了奥地利提出的全邦联动员反对普鲁士的议案。普鲁士以邦联议会越权为由，宣布邦联已经解散。6月15日普军侵入萨克森。战争实际上只延续了三周。6月24日奥军在库斯托查击败意军，但7月3日的萨多瓦战役中普军却决定性地击败了奥军。
    奥地利在败局已定之下，请求法国出面调停。此刻俾斯麦再次表现出机敏的政治家的克制。他力排普王和将军们继续进军维也纳的主张，接受了法国的调停，并提出了温和的停战条件：解散德意志邦联；奥地利退出德意志，并同意建立普鲁士为盟主的北德意志联邦。俾斯麦态度如此温和，出于两方面考虑：第一，尽早结束战争，防止法国的干涉。当时法国外交大臣特罗恩的政策是，如果普鲁士拒绝法国的调停，法国“就同奥地利结盟”对付普鲁士（24）。而这可能使普鲁士已取得的胜利化为乌有。俾斯麦因此正告普王和军界：“生活在欧洲的不光是我们自己，而且还有三个憎恨妒忌们的强国。”（25）第二，俾斯麦已达到了对奥战争的目的，即建立普鲁士在和德意志的霸权。而根据俾斯麦的逻辑，“在对奥地利战争之后，接踵而来的必然是对法国的战争。”（26）因此，“不羞辱奥地利是绝对必要的，不要干使未来与之友好相处不可能的事，”以免日后普法冲突时它会不顾一切地站在法国一边。
    1866年8月23日，普奥签订布拉格和约。和约对奥地利相当宽容：奥地利退出德意志；除了在两公国的一半利益外，它仅有的领土损失是将威尼西亚归还了意大利。
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    虽然1866年普奥战争将奥地利逐出了德意志，但它本身并没有彻底解决德国统一问题。1867年，以普鲁士为首的北德意志联邦建立，但美因河以南的巴登、巴伐利亚、符滕堡、黑森--达姆施塔特四邦却因法国的阻挠而滞留于北德联邦之外。拿破仑三世明确宣称：“德意志应划为三块，永远不得统一。”（27）俄英两国也反对普鲁士强行吞并南德地区。亚历山大二世在游历南德时便表示，坚决反对普鲁士“继续侵犯”该地区。英国外交大臣克拉林顿也表示，“不能容忍普鲁士以压力政策克服美因河界线。”（28）因此，要完成德国统一，必须克服法国的阻碍，并寻找可为英俄两国接受的时机。俾斯麦遂以此为目标展开了一系列外交活动。
    首先，对奥战争结束后，俾斯麦即通过与南德四邦的紧密关系，加强未来对法战争中普鲁士的地位和德意志内部的团结。1866年8月，他以宽大和约为交换条件，换取了南德四邦与普鲁士结成抵御法国进攻的攻守同盟。1867年，南德四邦加入关税同盟。这种军事和经济合作大大促进了德意志“政治上的进一步统一”（29）。
    其次，遏制法国的要求，为日后在国际上孤立法国设置外交陷井。俾斯麦为争取法国在普奥战争中中立，曾允诺予以“补偿”。当时法国的“补偿”目标有三个：莱因河西岸德意志地区、卢森堡和比利时。还在普奥停战协定签订前，法国驻柏林大使贝内德梯便向俾斯麦提出取得莱因河西岸德意志地区的要求。鉴于战局未完全明朗，俾斯麦对此并未加以拒绝。普奥停战后，当贝内德梯再次提出这一要求时，俾斯麦却一反常态地表示：“不可能将德国的任何边境地区让给法国，除非这些地区的居民自己表示愿意做法国臣民。”（30）贝内德梯碰壁而归。
    在卢森堡问题上，俾斯麦采用了一种更为策略的推托方式。卢森堡此时是荷兰国王属下的德意志邦联成员。1867年初，法国说服荷兰国王将卢森堡卖给法国，并就此征求普鲁士的意见。俾斯麦巧妙地安排当时以独立政见闻名的民族自由党领袖本尼格森在议会反对将卢森堡这块“古老的德意志土地”割让给法国，并以议会反对为由拒绝了法国的要求。鉴于普鲁士反对，荷兰国王出卖卢森堡之事作罢。1867年5月伦敦会议上，卢森堡被宣布为各大国保证的中立国，但“经济上卢森堡仍保留于‘德意志关税同盟’中并因此而继续从属德意志关税区域。”（31）结果，法国的补偿要求再次落空，普鲁士却实在地享受着卢森堡的经济利益。
    比利时问题是俾斯麦耍弄法国并使之日后孤立于国际社会的杰作。1866年8月，贝内德梯与俾斯麦谈判卢森堡和比利时并入法国之事。俾斯麦以提交普王讨论为由，让贝内德梯将法国的要求尤其对比利时的要求写成一份书面材料。在得到这份法国对比利时野心的凭据后，他便以普王尚未研究此问题为由，中止了谈判。日后人们才知道，俾斯麦此举在于搜集法国侵略的证据，并展示给国际社会。在与法国周旋的同时，俾斯麦还将法国的要求暗示英俄两国。结果，当英国驻巴黎大使考乌里勋爵探询比利时问题时，拿破仑三世措手不及，赶忙表示：“不想用武力或威胁取得任何领土。”（32）法国再次空手而归。
    再次，俾斯麦细心洞察欧洲各大国间的关系，不失时机地加以利用，孤立法国。此时欧洲各列强特别英俄的态度对普有利而于法无益。英国认为，法国乃当时最具与之海上及殖民争霸实力的强敌，俄国是其争夺中亚地区的主要对手，因此，它希望“加强中欧以反对其周边的两大强国，”而不会站在法国一边压制普鲁士。