但是，只有传染病媒介物，还不足以促成疫病的流行，还必须明白知道人的生理条件和特点。他们认为，只有在研究人的生理特点的基础上，才能知道用人工方法引起疫病流行的条件，所以731部队早在1933年加茂部队时期起，就用活人进行实验，来研究这种生理特点了。而为了用活人进行实验，在部队内设立了特殊的监狱，专门关押供实验用的中国人、苏联人和其他国家人。据调查，仅1940年至1945年的5年中，在731部队内因被传染致命细菌而死亡的至少有3000人，1940年以前死亡的还没有计算在内。
    其他的细菌战部队也都用活人做试验。如1644部队就用大批俘虏进行细菌试验，据日本学者森正孝和《每日新闻》记者朝野富三对17个日本当事人进行的调查，1644部队还与“九研”一起进行活人试验，其证言是：实验在极度秘密的情况下，于1644部队内供研究用的建筑物中进行，为防泄密，直接参加者限“九研”工作人员7人和1644部队军医2人。“九研”工作人员装作军医，在中国男俘胳膊上注射大剂量的剧毒和氰酸，观测其反应。一个亲自把氰酸注射到中国男子身上的“九研”技术人员A（住东京，1905年生）说：“若被（俘虏）察觉而闹起来就不好办了，所以干净利落地注射。该男子立即发生痉挛，身体哆嗦，微微颤抖。仅几十秒钟，就一边抽搐，一边气息奄奄。心脏完全停止跳动只几分钟。”（注：森正孝等：《日本对中国的侵略》，明石书店，1991年版，第461-462页。）
    最后，参谋本部批准了三种使用细菌武器的方法，即：一，由战斗机撒播细菌；二，从飞机上投掷特种细菌炸弹；三，用细菌在地面上传染居民点、蓄水池、水井和牧场等等。
    三、日本军部命令对中国进行细菌攻击和积极准备对苏联进行细菌战
    日本细菌战部队在研究制造细菌武器的同时，就在中国一些地区不断使用细菌进行破坏活动，致使疫病流行，中国居民大量死亡（注：后来日本参谋本部和陆军训练总监部拟定的《军事破坏队阵中教范》中，特别指示使用细菌武器进行破坏。帝国大本营陆军处第二部颁布的采用军事破坏队的指令中，具体地提到使用自来水笔式的细菌“手枪施放器”。这种自来水笔式的细菌喷射器，每排4支，连部3支。）。到1941年，日本军部细菌战的准备工作已经基本完成，大批制造细菌武器的条件已经具备。于是，在实验室及打靶场条件下进行的实验，就扩展为准备进行大规模细菌战和对中国和平居民进行罪恶的细菌攻击了。
    在此之前，1939年8月下旬，石井四郎就遵照参谋本部的命令，在对苏、蒙的诺门坎战役中，进行了一次小规模的细菌战实验，在哈勒欣河撒下了肠伤寒与沙门氏菌。但由于当时该部队还缺乏适当的撒播手段，细菌在流水中立即失去感染力，收效甚微（注：《远藤三郎日记》，见《日本侵华研究》第三期。）。尽管如此，日本军部对这次行动仍十分重视，731部队不仅得到了关东军第六军司令官荻洲立兵中将颁发的奖状，日本大本营陆军部还于次年5月23日在各报刊登了授予该部队奖状的消息。
    1941年6月，德国向苏联发起突破进攻，日本军部趁德苏战争之机加紧对苏备战，命令关东军进行重大军事调动，即所谓的“关特演”（关东军特别大演习），以便能在战局对日本最为有利的时刻，以武力解决北方问题。这时，日本军部就考虑使用细菌武器。为此，参谋总长向731部队下达了“指示信”，命令731部队加紧研究鼠疫细菌，作为对苏攻击的武器。还特别指示大量培养跳蚤，作为撒播鼠疫菌的媒介物，称“鼠疫跳蚤有巨大的战略意义”。（注：731部队生产部部长军医少将川岛清受审记录，见《前日本陆军军人因准备和使用细菌武器被控案审判材料》，莫斯科外国文书籍出版局，1950年。以下各细菌战犯受审记录均出此书。）与此同时，帝国大本营参谋本部也给关东军总司令发布训令，命令“着手准备进行对苏的细菌战”，关东军总司令为此专门召集会议，研究对苏的细菌战问题。（注：关东军兽医部长高桥隆笃中将受审记录。）
    1941年12月，日本偷袭珍珠港挑起太平洋战争以后，日本军部又决定进一步发展生物化学武器，以“剿灭敌对民族”。这份由参谋本部作战课制定的文件，已由日本立教大学讲师伊香俊哉于1994年12月在日本防卫研究所图书馆发现，文件共14页，其中要求进一步扩大731细菌战部队的规模（注：《人民日报》，1994年12月10日。）。
    在这以后，据日本防卫研究所图书馆收藏的日军作战参谋日记说：“1940年9月18日，日军细菌战部队（主要是731部队和南京的1644部队）在中国宁波、金华、玉山、台州、丽水进行细菌攻击。”其10月7日的日记说：“迄今为止，已经发动了六次（这样的）攻击”，并对以后撒播细菌的方法进行了讨论。第二年11月4日，又派遣一架九七式轻型轰炸机在湖南常德撒播了36公里长的染疫（鼠疫）跳蚤带。两周后，就收到了该地区大量流行鼠疫的报告（注：《朝日新闻》，1993年8月14日。）。由于当时处于战时条件下以及与此有关的民众大量迁移等情况，在浙江、湖南的广泛范围内，引起了疫病流行，中国和平居民大批死亡。
    至1942年，参谋本部命令731部队在中国的浙赣地区进行了一次大规模的细菌攻击，目的是探究使用细菌武器的最好方法“地面传染法”，即在日军作“战略退却”时，在铁路沿线一带施放细菌，日本军部设在南京的荣字1644部队也参加了这次攻击。这次细菌攻击，使中国大批和平居民死亡，以义乌县崇山村为例，全家死光的就有30户左右。第二年日本皇族三笠宫到1644部队视察时，该部队还特别制作了16毫米的电影供他观看，内容是该部队一科饲养白鼠，培育鼠蚤的情况和部队在作战中撒播细菌的情况，还把电影中的许多镜头印成照片，编成相册，给三笠宫带回日本去（注：1644部队军画兵石田甚太郎《人生日记》，见〔日〕《战争责任研究》，第10号。）。
    这样，到1942年，日本细菌战部队制造出几种能在战时广泛使用的有效细菌武器的任务，已经完全解决。这些武器，是用大量活人来试验过，并在几次用细菌攻击中国的行动中，即在成千上万无法自卫的平民妇孺身上，检验了各种细菌的致病效能的。