《后汉书·西域传》在总结西域交通时，称：
    自敦煌西出玉门、阳关，涉鄯善北，通伊吾千余里，自伊吾北（应为西）通车师前部高昌壁千二百里，自高昌壁北通后部金满城五百，此其西域之门户也。引文中的个别用词虽不见当，但出玉门关达伊吾、车师等地的交通路线，已为当时人所共认。至此，通西域只有一条路的历史基本结束。
    较《后汉书》成书更早的《魏略·西戎传》，记载更为详细、具体：
    从敦煌玉门关入西域，前有二道，今有三道。从玉门关西出，经若羌，转西越葱岭，经县度，入大月氏，为南道。从玉门关西出，发都护井，回三陇沙北头经居卢仓，从沙西井转西北过龙堆，到故楼兰转西诣龟兹，至葱岭，为中道。从玉门关西北出，经横坑，辟三陇沙及龙堆，出五船，北到车师界戊己校尉治所高昌，转西与中道合龟兹，为新道。
    此“新道”的前半部分，即“五船道”。如此说，五船当不在前人研究认为的奇台县东北至十三间房一段，而在今鄯善县以南的库鲁克塔克山脉以北。《魏略》所记，基本上指明了五船道的走向，它与《后汉书》所记从玉门、阳关出发，先至伊吾卢，再转西到高昌壁，似为二道，一道先至伊吾卢，转西到高昌壁；一道经五船，直至高昌壁，说明两道当时都是可以通行的。
    三、“故商客往来，多取伊吾路”
    魏、晋以来，中原政权分立，更替频繁，各割据政权为了扩大势力竟相遣使通西域，西域各国也纷纷遣使来朝，中原各王朝对西域的行政管辖虽时断时续，但各族人民间的交往不仅没有中止，反而似乎更广泛更深入起来。在此期间，建立在北方地区的政权比南方政权与西域关系更加密切，往来人数更多，基本掌握着这条道路的主动权。
    曹魏统一凉州后，积极恢复对西域的统治与经营，依汉制设西域长史。黄初二年（221）拜关内侯张恭任西域戊己校尉，驻高昌，次年兼西域长史。后西域长史移驻海头（罗布泊西北），恭子就任戊己校尉。不久，在伊吾恢复宜禾都尉，依汉例，主屯田。车师后王壹多杂降汉，魏赐为侍中。这些统一措施，促进了西域东北部社会秩序的安定，有利于发展生产，对整个西域的发展和中西交通的畅通都起了积极作用。司马氏代魏，建立晋朝。晋对西域的政策因袭曹魏不变。
    西晋灭亡后，占据武威的张氏继续奉东晋为正朔，统治河西。威和二年（327），张骏发兵击平反抗他的西域戊己校尉赵贞，统一西域东北部，在车师前部地设立高昌郡，是为西域设郡的开始。咸康元年（335），又派前凉沙州刺史杨宣出西域，龟兹、鄯善、焉耆、于田之属皆降，遂“分敦煌、晋昌、高昌三郡及西域都护、戊己校尉、玉门大护军三营为沙州，以西胡校尉杨宣为刺史”（12），把敦煌郡与西域地区统一在一个军政管辖区之下，又以敦煌人索孚为伊吾都尉，领屯田。
    苻秦兴起，逐渐统一凉州。建元十二年（376）命高昌杨干为高昌太守。十八年（382）苻坚命骁骑将军吕光为使持节、都督西域征讨诸军事，“总兵七（又作十）万，铁骑五千”（13），以讨西域之不服者。这是从玉门至高昌路开通以来，人数最多的一次军队过境。光从玉门至高昌，经沙漠到焉耆，降服龟兹，统一西域，取得了巨大胜利。二十年（384），苻坚在淝水之战中失败，次年，吕光从龟兹东返，至宜禾，坚“高昌太守杨翰（干）说其凉州刺史梁熙，距守高桐（一作梧）、伊吾二关，熙不从。光至高昌，翰以郡迎降。”（14）《资治通鉴·晋纪》在此补充云：“高昌太守杨翰言于熙曰：吕光新破西域，兵强气锐，闻中原丧乱，必有异图。河西地方万里，带甲十万，足以自保。若光出流沙，其势难敌。高梧谷口险阻之要，宜先守之而夺其水；彼既穷渴，可以坐制。如以为远，伊吾关亦可拒也。”但梁熙没有采纳杨翰的建议，吕光经高昌，留子覆为都督玉门以西诸军事、西域大都护，镇高昌，自己领兵返玉门。
    高梧（桐）、伊吾二关是高昌至玉门间的重要关口。考其位置，高梧谷口险阻之要，而夺其水，则其必在山谷口，且拥有水源。从“如以为远”看，其位置当距高昌郡境不远，当为鄯善以南某山谷口。伊吾关不在汉伊吾卢城，而在敦煌郡北。《元和郡县图志》卷四十《伊州》条记：“自魏立伊吾县，晋立伊吾都尉，并寄理敦煌北界，非今之伊州。”唐伊州治今哈密，而魏晋寄理敦煌郡北界的伊吾县、伊吾都尉，并非常制，而是临时措施。从西凉政权灭亡后其家属后裔逃亡伊吾、死于伊吾的实情看，伊吾卢地的农业生产仍在继续，而真正寄理敦煌郡北界的是伊吾关，敦煌郡通伊吾卢的关口、供应点之一。伊吾关的设立，说明当时敦煌与伊吾间的交通路线仍在逐渐加强。西凉将唐和与光契拥外甥李宝“避难伊吾，招集民众二千余家，臣于蠕蠕以契为伊吾王”（15），大概就是经伊吾关到达伊吾卢的。能迅速召集民众二千余家，说明当地从事农业生产的中原裔民，人数仍然可观。
    北魏自太武帝拓跋焘起，势力强盛，有统一西域之志，频遣使者至西域，由北凉沮渠氏护送出流沙。太延元年（435），魏遣王恩生、许纲使西域，渡流沙，为蠕蠕所执。三年（437），复遣董琬、高明等前往，西至乌孙、者舌、破洛那等国。五年还，奏称：西域“分其地为四域”，“其出西域，本有两道，后更为四：出自玉门，度流沙，西行两千里至鄯善为一道；自玉门度流沙，北行二千二百里至车师为一道；……”（16）此玉门至车师的里程，与《后汉书·西域传》“自敦煌西出玉门、阳关，涉鄯善北，通伊吾千余里；自伊吾北（西）通车师前部高昌壁千二百里”两里程相加之数大致相符，可能是先至伊吾，后至车师之道路。又据《大唐慈恩寺三藏法师传》：法师“既为高昌所请，辞不获免，于是遂行，涉南碛，经六日，至高昌白力城。”《续高僧传》卷十二《释道判传》：“乘机急行，止经七夕，便至高昌国。”六日和七夕，仅一天之差，但七天在沙碛中行二千二百里，是不可能的。可见二千二百里，是指出伊吾关，经伊吾卢地至车师的里程，与玄奘所经莫贺延碛不是一路。
    伊吾路的发展并成为主干道，与高昌王国的建立有重大关系。
    自前凉张骏于东晋咸和二年（327）设立高昌郡，置太守，后凉因之，以后断断续续，多有设置。任其职者，又多有领护西域之责，于是高昌地位不断提高。
    北魏太延五年（439），拓跋焘使者在北凉武威听沮渠牧鞬僚属闲言，决定对在北魏统一西域过程中为其立过迎送之功的北凉政权采取行动，俘沮渠牧鞬，灭北凉。牧犍弟酒泉太守沮渠无讳与沮渠安周西走，渡流沙，击鄯善，安周据之，无讳经焉耆北取昌，拔其城，占领高昌，时在魏太平真君三年（442）。无讳自称大凉王，恢复北凉政权，刘宋封其为“持节散骑常侍、都督凉河沙三州诸军事、征西大将军、领护匈奴中郎将、西夷校尉、凉州刺史、河西王”。五年（444）无讳病死，弟安周继承其位，仍沿用“承平”年号，号大凉。承平十八年（460），大凉为柔然所灭，柔然占有其地。