1776年11月，他在弗吉尼亚议会里发言中特别反对国家干涉宗教。他举出的理由很有说服力：第一，人们组织政府的目的是为了保障人民的一系列权利和自由，其中包括宗教信仰的自由；第二，人们信仰宗教完全是个人私事，无论信仰什么，都不会损害别人。后来他在《论弗吉尼亚的笔记》中对这一点作了进一步解释：“政府全部权力只能干涉可以伤害别人的那种行为。但是我们的邻居说有20个上帝或没有上帝，对我并无损害。他并没有掏我的钱包也没有打坏我的腿”（29）。
    值得注意的是，杰弗逊强调宗教自由，而不是宗教宽容。过去人们针对宗教压迫，往往要求宽容。实际上宽容是以某种宗教占统治地位为前提的，只不过以宽大为怀的态度容忍其他教派的存在而已。宗教自由则更进了一大步，就是说取消任何占统治地位的宗教。杰弗逊等人在1776年提倡的宗教自由包含两层意思：一方面是摆脱一切宗教压迫，另一方面个人按照自己的良心的指示自由地信仰某种宗教，而不受任何外来干涉（30）。
    杰弗逊对于政府干涉宗教自由的恶劣影响及宗教自由的好处分析得非常深刻，可谓一针见血。他指出：政府干涉宗教自由，强迫人民信仰一致，不但没有好处，而且带来恶果。他说：“自从引进基督教以来，数百万无辜的男女和儿童被烧死、被折磨，被处罚金和被监禁，然而我们并没有向思想上的一致前进一英寸。强迫的效果是什么呢？在世界上制造出一半愚人及另一半伪善者。”这就是说，强迫思想上的一致，只能造成人们的愚昧和虚伪。他又说：“只有谬误的思想才需要政府的支持”。真理本身是用不着权威来支持的。宗教上的差异，不同思想的自由竞争，对于真理的发展是有百利而无一害的（31）。
    杰弗逊在《论弗吉尼亚的笔记》中进一步说明限制宗教自由的害处及实行宗教自由的好处。他写道：“限制［思想］会使他成为伪君子，从而使他变得更坏，而绝不会使他成为一个更为诚实的人。它会使他顽强地坚持他的错误，而不会把他治疗痊愈。理性和自由探讨是对付错误的唯一有效的手段。对他们放松，他们就会支持真正的宗教，因为放松对他们的限制，就会把每一个谬误带到他们的裁判所来受他们研究的考验。它们（指理性和自由探讨--引者注）是谬误的天然的敌人，而且只是谬误的天然敌人。”（32）
    杰弗逊在他草拟的“宗教自由法案”中也发挥了同样的道理。他写道：人心既不能加以限制，也不能加以恫吓，因为“靠肉体上的惩罚或劳累或剥夺公民资格去影响它的一切企图，只有助于引起伪善及卑鄙的习惯”。杰弗逊在这里还谴责“立法者及统治者（既包括教会的也包括世俗和民政的）的暴虐专横”。并指出这些人“自己就是容易犯错误的、平凡的人，而同时却硬要统制别人的信仰。”（33）
    杰弗逊反对政府与教会的结合，反对政府干涉个人的宗教信仰。他说：“我们的公民权利并不依靠我们的宗教意见，正如它不依靠我们在物理或地质学方面的见解一样”。“让民政官和他的权力伸入意见领域，并且以推测他们有坏的倾向为理由而限制他们发表和传播他们的原则，是一个危险的谬误”。
    在法案的序言里有这样一段话：
    “……真理是伟大的，而如果对它不加干涉的话，它会胜利的，她有足够的力量去对付谬误，她是不害怕斗争的，除非靠人为的干涉去解除她的天然的武装，禁止自由辩论及争论。在允许自由地反对谬误的地方，谬误就不再是危险的了。”（34）
    其实杰弗逊在此不仅为宗教自由作辩护，而且也在替言论自由，思想自由作辩护。
    由于杰弗逊在宗教问题上有这样深刻的认识，所以他积极推动弗吉尼亚议会制定关于宗教自由的法律，1776年10月他被选进弗吉尼亚议会后不久就被任命为处理宗教问题的十九人委员会成员之一。但是这个委员会意见纷纭，争论很激烈，闹成僵局，所以经过一个月讨论后，委员会被解散。同年11月议会又指定一个新的委员会，杰弗逊又是其成员。但是议会最后到12月不顾他的反对，通过了很不彻底的法令，该法令只是取消了异教派的教徒纳税支持官方教会牧师的办法，而没规定其他改革，它并没取消官方教会本身，也没有实现宗教自由。弗吉尼亚人仍由于异教思想而受惩罚（35）。
    因此，以杰弗逊为首的宗教自由的战士们再接再厉地奋斗下去。1779年杰弗逊在立法会议中提出一项宗教自由法案，经过尖锐争论，1786年才被通过（36）。
    1786年通过的“宗教自由法案”写道：“一切人在宗教见解上都应享有充分的自由；不得强迫任何人去教堂作礼拜或出钱充作教会的经费，也不许根据他的宗教见解和信仰对他的人身或财产实行强制、限制、干扰或使他负重担，也不许用其他手段去折磨他；一切人都可以自由地表白，并且根据道理去坚持他们在宗教问题上的见解，而不得由于他这样做而削减、扩大或影响他的公民权能”（37）。
    麦迪逊宣称这个法令“永远消灭了为了限制人的思想而制定法律的狂妄的希望”。
    这个法令通过时，它的提案人杰弗逊正在巴黎。他在1786年末写信给麦迪逊，谈到它在欧洲引起广泛的欢呼，“我不是指的政府，而是指的组成政府的个人。它已被译成意大利文，并且被送到欧洲大多数宫廷中去……它被加进新百科全书中去，并且出现在有关美国的大多数出版物中。在人们的心灵被国王、教士及贵族禁锢了许多世纪之后看到理性的旗帜终于树立起来，真是令人感到慰藉；我们之创造这第一部立法并且有勇气宣布在发表自己的意见方面可以信赖人的理性，这太光荣了。”（38）
    弗吉尼亚的宗教自由虽然实现了，但它是经过长期的、曲折的道路的，这主要是因为在这个州占统治地位的圣公会教徒与被统治的教派的教徒在人数上基本相等，甚至稍稍越过后者，而且圣公会还得到许多有钱有势的种植场主的支持（39）。
    在马里兰、纽约及最南方的几个州，圣公会这个官方教会早在革命斗争初期就被摧毁，遇到的阻力不大（40）。这是因为在这几个州里圣公会的信徒，在整个人口中只占少数（41）。但是新英格兰的四个州中有三个州，公理会继续是官方教会（45）。新罕布什尔公理会作为官方教会继续存在到1817年，康涅狄格到1818年，麻萨诸塞到1833年（42）。这主要是因为在这几个殖民地上，作为官方教会的公理会教会的信徒在居民中占大多数，异教派教徒占少数。